BDDE ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് ഓട്ടോക്ലേവിൽ പുതിയ പ്രതികരണ ഉപോൽപ്പന്നങ്ങൾ കണ്ടെത്തൽ

നിങ്ങളുടെ ബ്രൗസറിൽ നിലവിൽ Javascript പ്രവർത്തനരഹിതമാണ്.ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുമ്പോൾ, ഈ വെബ്‌സൈറ്റിന്റെ ചില പ്രവർത്തനങ്ങൾ പ്രവർത്തിക്കില്ല.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philipp Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * ഈ രചയിതാക്കൾക്ക് ഈ കൃതികളിൽ ചില കൃതികൾ ഉണ്ട്. സംഭാവന പശ്ചാത്തലം: ഹൈലൂറോണിക് ആസിഡ് (HA) പ്രകൃതിദത്തമായ പോളിസാക്രറൈഡാണ്, ഇത് സൗന്ദര്യാത്മക ആവശ്യങ്ങൾക്കായി ഡെർമൽ ഫില്ലറുകൾ നിർമ്മിക്കുന്നു.മനുഷ്യ കോശങ്ങളിൽ ഇതിന് നിരവധി ദിവസങ്ങളുടെ അർദ്ധായുസ്സ് ഉള്ളതിനാൽ, എച്ച്എ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ചർമ്മ ഫില്ലറുകൾ ശരീരത്തിൽ അവയുടെ ആയുസ്സ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് രാസപരമായി പരിഷ്ക്കരിക്കുന്നു.എച്ച്എ ശൃംഖലകളെ ക്രോസ്‌ലിങ്ക് ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ക്രോസ്‌ലിങ്കിംഗ് ഏജന്റായി 1,4-ബ്യൂട്ടേഡിയോൾ ഡിഗ്ലൈസിഡൈൽ ഈതർ (ബിഡിഡിഇ) ഉപയോഗിക്കുന്നതാണ് വാണിജ്യ എച്ച്എ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഫില്ലറുകളിലെ ഏറ്റവും സാധാരണമായ പരിഷ്‌ക്കരണം.ശേഷിക്കുന്നതോ പ്രതികരിക്കാത്തതോ ആയ ബിഡിഡിഇയെ വിഷരഹിതമായി കണക്കാക്കുന്നത് <2 പാർട്സ് പെർ മില്യൺ (പിപിഎം);അതിനാൽ, രോഗിയുടെ സുരക്ഷ ഉറപ്പാക്കാൻ അന്തിമ ഡെർമൽ ഫില്ലറിലെ ശേഷിക്കുന്ന ബിഡിഡിഇ അളക്കണം.മെറ്റീരിയലുകളും രീതികളും: ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിയും മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രിയും (എൽസി-എംഎസ്) സംയോജിപ്പിച്ച് ആൽക്കലൈൻ അവസ്ഥയിൽ ബിഡിഡിഇയും എച്ച്എയും തമ്മിലുള്ള ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് പ്രതികരണത്തിന്റെ ഒരു ഉപോൽപ്പന്നത്തിന്റെ കണ്ടെത്തലും സ്വഭാവവും ഈ പഠനം വിവരിക്കുന്നു.ഫലങ്ങൾ: വ്യത്യസ്ത വിശകലനങ്ങൾക്ക് ശേഷം, HA-BDDE ഹൈഡ്രോജലിനെ അണുവിമുക്തമാക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന ആൽക്കലൈൻ അവസ്ഥകളും ഉയർന്ന താപനിലയും ഈ പുതിയ ഉപോൽപ്പന്നമായ "പ്രൊപിലീൻ ഗ്ലൈക്കോൾ പോലെയുള്ള" സംയുക്തത്തിന്റെ രൂപീകരണത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിച്ചതായി കണ്ടെത്തി.LC-MS വിശകലനം, ഉപ-ഉൽപ്പന്നത്തിന് BDDE-യുടെ അതേ മോണോ ഐസോടോപ്പിക് പിണ്ഡവും വ്യത്യസ്ത നിലനിർത്തൽ സമയവും (tR), മറ്റൊരു UV ആഗിരണം (λ=200 nm) മോഡും ഉണ്ടെന്ന് സ്ഥിരീകരിച്ചു.ബിഡിഡിഇയിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, എൽസി-എംഎസ് വിശകലനത്തിൽ, അതേ അളവെടുപ്പ് സാഹചര്യങ്ങളിൽ, ഈ ഉപോൽപ്പന്നത്തിന് 200 nm-ൽ ഉയർന്ന കണ്ടെത്തൽ നിരക്ക് ഉണ്ടെന്ന് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.ഉപസംഹാരം: ഈ പുതിയ സംയുക്തത്തിന്റെ ഘടനയിൽ എപ്പോക്സൈഡ് ഇല്ലെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.വാണിജ്യ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി എച്ച്എ-ബിഡിഡിഇ ഹൈഡ്രോജൽ (എച്ച്എ ഡെർമൽ ഫില്ലർ) ഉൽപ്പാദനത്തിൽ കണ്ടെത്തിയ ഈ പുതിയ ഉപോൽപ്പന്നത്തിന്റെ അപകടസാധ്യത വിലയിരുത്താൻ ചർച്ച തുറന്നിരിക്കുന്നു.കീവേഡുകൾ: ഹൈലൂറോണിക് ആസിഡ്, എച്ച്എ ഡെർമൽ ഫില്ലർ, ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് ഹൈലൂറോണിക് ആസിഡ്, ബിഡിഡിഇ, എൽസി-എംഎസ് വിശകലനം, ബിഡിഡിഇ ഉപോൽപ്പന്നം.
ഹൈലൂറോണിക് ആസിഡ് (HA) അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഫില്ലറുകൾ സൗന്ദര്യവർദ്ധക ആവശ്യങ്ങൾക്കായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ഏറ്റവും സാധാരണവും ജനപ്രിയവുമായ ഡെർമൽ ഫില്ലറുകളാണ്.1 ഈ ഡെർമൽ ഫില്ലർ ഒരു ഹൈഡ്രോജൽ ആണ്, സാധാരണയായി 95% വെള്ളവും 0.5-3% എച്ച്എയും ചേർന്നതാണ്, ഇത് അവർക്ക് ജെൽ പോലെയുള്ള ഘടന നൽകുന്നു.2 എച്ച്എ ഒരു പോളിസാക്രറൈഡും കശേരുക്കളുടെ എക്സ്ട്രാ സെല്ലുലാർ മാട്രിക്സിന്റെ പ്രധാന ഘടകവുമാണ്.ചേരുവകളിൽ ഒന്ന്.ഇതിൽ (1,4) -ഗ്ലൂക്കുറോണിക് ആസിഡ്-β (1,3)-എൻ-അസെറ്റൈൽഗ്ലൂക്കോസാമൈൻ (GlcNAc) ആവർത്തിച്ചുള്ള ഡിസാക്കറൈഡ് യൂണിറ്റുകൾ ഗ്ലൈക്കോസിഡിക് ബോണ്ടുകളാൽ ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.ഈ ഡിസാക്കറൈഡ് പാറ്റേൺ എല്ലാ ജീവികളിലും സമാനമാണ്.ചില പ്രോട്ടീൻ അധിഷ്‌ഠിത ഫില്ലറുകളുമായി (കൊളാജൻ പോലുള്ളവ) താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, ഈ ഗുണം എച്ച്‌എയെ വളരെ ബയോകോംപാറ്റിബിൾ തന്മാത്രയാക്കുന്നു.ഈ ഫില്ലറുകൾക്ക് അമിനോ ആസിഡ് സീക്വൻസ് പ്രത്യേകത പ്രകടിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, അത് രോഗിയുടെ രോഗപ്രതിരോധ സംവിധാനത്താൽ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും.
ഒരു ഡെർമൽ ഫില്ലറായി ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ, HA യുടെ പ്രധാന പരിമിതി, ഹൈലുറോണിഡേസ് എന്ന എൻസൈമുകളുടെ ഒരു പ്രത്യേക കുടുംബത്തിന്റെ സാന്നിധ്യം മൂലം ടിഷ്യൂകൾക്കുള്ളിലെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള വിറ്റുവരവ് ആണ്.ഇതുവരെ, ടിഷ്യൂകളിലെ എച്ച്എയുടെ അർദ്ധായുസ്സ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിന് എച്ച്എ ഘടനയിലെ നിരവധി രാസമാറ്റങ്ങൾ വിവരിച്ചിട്ടുണ്ട്.3 ഈ പരിഷ്കാരങ്ങളിൽ ഭൂരിഭാഗവും എച്ച്എ ചെയിനുകൾ ക്രോസ്-ലിങ്ക് ചെയ്യുന്നതിലൂടെ പോളിസാക്രറൈഡ് പോളിമറുകളിലേക്കുള്ള ഹൈലൂറോണിഡേസിന്റെ പ്രവേശനം കുറയ്ക്കാൻ ശ്രമിക്കുന്നു.അതിനാൽ, പാലങ്ങളുടെ രൂപീകരണവും എച്ച്എ ഘടനയും ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് ഏജന്റും തമ്മിലുള്ള ഇന്റർമോളിക്യുലർ കോവാലന്റ് ബോണ്ടുകളും കാരണം, ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് എച്ച്എ ഹൈഡ്രോജൽ സ്വാഭാവിക എച്ച്എയേക്കാൾ കൂടുതൽ എൻസൈം ഡീഗ്രഡേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു.4-6
ഇതുവരെ, ക്രോസ്ലിങ്ക്ഡ് എച്ച്എ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന കെമിക്കൽ ക്രോസ്ലിങ്കിംഗ് ഏജന്റുമാരിൽ മെതാക്രിലമൈഡ്, 7 ഹൈഡ്രാസൈഡ്, 8 കാർബോഡിമൈഡ്, 9 ഡിവിനൈൽ സൾഫോൺ, 1,4-ബ്യൂട്ടേഡിയോൾ ഡിഗ്ലൈസിഡൈൽ ഈതർ (ബിഡിഡിഇ) പോളി(എഥിലീൻ ഗ്ലൈക്കോൾ) ഡിഗ്ലൈസിഡൈൽ ഈതർ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.10 ,11 BDDE ആണ് നിലവിൽ ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന ക്രോസ്ലിങ്കിംഗ് ഏജന്റ്.ഇത്തരത്തിലുള്ള ഹൈഡ്രോജലുകൾ പതിറ്റാണ്ടുകളായി സുരക്ഷിതമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ഉപയോഗിക്കുന്ന ക്രോസ്ലിങ്കിംഗ് ഏജന്റുകൾ സൈറ്റോടോക്സിക് ആയിരിക്കാം, ചില സന്ദർഭങ്ങളിൽ മ്യൂട്ടജെനിക് ആയ റിയാക്ടീവ് റിയാക്ടറുകളാണ്.12 അതിനാൽ, അന്തിമ ഹൈഡ്രോജലിൽ അവയുടെ ശേഷിക്കുന്ന ഉള്ളടക്കം ഉയർന്നതായിരിക്കണം.ശേഷിക്കുന്ന ഏകാഗ്രത ദശലക്ഷത്തിൽ 2 ഭാഗങ്ങളിൽ (പിപിഎം) കുറവായിരിക്കുമ്പോൾ BDDE സുരക്ഷിതമായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു.4
ഗ്യാസ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി, സൈസ് എക്‌സ്‌ക്ലൂഷൻ ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി കപ്പിൾഡ് മാസ് സ്പെക്‌ട്രോമെട്രി (എംഎസ്), ന്യൂക്ലിയർ മാഗ്നെറ്റിക് റെസൊണൻസ് (എൻഎംആർ) ഫ്ലൂറസെൻസ് മെഷർമെന്റ് രീതികൾ, എച്ച്എ ഹൈഡ്രോജലുകളിൽ കുറഞ്ഞ അവശിഷ്ട ബിഡിഡിഇ കോൺസൺട്രേഷൻ, ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് ഡിഗ്രി, സബ്‌സ്റ്റിറ്റ്യൂഷൻ പൊസിഷൻ എന്നിവ കണ്ടെത്തുന്നതിന് നിരവധി രീതികളുണ്ട്. ഡയോഡ് അറേ കപ്പിൾഡ് ഹൈ പെർഫോമൻസ് ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി (HPLC).13-17 ആൽക്കലൈൻ അവസ്ഥയിൽ BDDE, HA എന്നിവയുടെ പ്രതിപ്രവർത്തനം വഴി ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്ന അന്തിമ ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് HA ഹൈഡ്രോജലിലെ ഒരു ഉപോൽപ്പന്നത്തിന്റെ കണ്ടെത്തലും സ്വഭാവവും ഈ പഠനം വിവരിക്കുന്നു.HPLC, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി-മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (LC-MS വിശകലനം).BDDE-യുടെ ഈ ഉപോൽപ്പന്നത്തിന്റെ വിഷാംശം അജ്ഞാതമായതിനാൽ, അന്തിമ ഉൽപ്പന്നത്തിൽ BDDE-യിൽ സാധാരണയായി നടത്തുന്ന രീതിക്ക് സമാനമായ രീതിയിൽ അതിന്റെ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ അളവ് നിർണ്ണയിക്കണമെന്ന് ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.
HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) ലഭിച്ച സോഡിയം ഉപ്പ് തന്മാത്രാ ഭാരം ~1,368,000 Da (ലോറന്റ് രീതി) 18, ആന്തരിക വിസ്കോസിറ്റി 2.20 m3/kg.ക്രോസ്‌ലിങ്കിംഗ് പ്രതികരണത്തിനായി, BDDE (≥95%) Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) ൽ നിന്ന് വാങ്ങി.സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച് കമ്പനിയിൽ നിന്ന് pH 7.4 ഉള്ള ഫോസ്ഫേറ്റ് ബഫർഡ് സലൈൻ വാങ്ങി.LC-MS വിശകലനത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന എല്ലാ ലായകങ്ങളും അസെറ്റോണിട്രൈലും വെള്ളവും HPLC ഗ്രേഡ് ഗുണനിലവാരത്തിൽ നിന്ന് വാങ്ങിയതാണ്.ഫോർമിക് ആസിഡ് (98%) റീജന്റ് ഗ്രേഡായി വാങ്ങുന്നു.
എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളും ഒരു UPLC അക്വിറ്റി സിസ്റ്റത്തിൽ (വാട്ടേഴ്സ്, മിൽഫോർഡ്, MA, USA) നടത്തി, കൂടാതെ ഇലക്ട്രോസ്പ്രേ അയോണൈസേഷൻ സോഴ്സ് (AB SCIEX, Framingham, MA, USA) സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്ന API 3000 ട്രിപ്പിൾ ക്വാഡ്രുപോൾ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചു.
1% ആൽക്കലി (സോഡിയം ഹൈഡ്രോക്സൈഡ്, NaOH) സാന്നിധ്യത്തിൽ 10% (w/w) സോഡിയം ഹൈലൂറോണേറ്റ് (NaHA) ലായനിയിൽ 198 mg BDDE ചേർത്ത് ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് HA ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ സമന്വയം ആരംഭിച്ചു.പ്രതികരണ മിശ്രിതത്തിലെ അവസാന BDDE സാന്ദ്രത 9.9 mg/mL (0.049 mM) ആയിരുന്നു.തുടർന്ന്, പ്രതികരണ മിശ്രിതം നന്നായി കലർത്തി ഏകതാനമാക്കി 4 മണിക്കൂർ 45 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ തുടരാൻ അനുവദിച്ചു.19 പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ pH ~12 ആയി നിലനിർത്തുന്നു.
അതിനുശേഷം, പ്രതികരണ മിശ്രിതം വെള്ളത്തിൽ കഴുകി, അവസാന HA-BDDE ഹൈഡ്രോജൽ ഫിൽട്ടർ ചെയ്യുകയും PBS ബഫർ ഉപയോഗിച്ച് നേർപ്പിക്കുകയും 10 മുതൽ 25 mg/mL വരെ HA സാന്ദ്രത കൈവരിക്കുകയും അവസാന pH 7.4 നേടുകയും ചെയ്തു.ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് എച്ച്എ ഹൈഡ്രോജലുകളെ അണുവിമുക്തമാക്കുന്നതിന്, ഈ ഹൈഡ്രോജലുകളെല്ലാം ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (20 മിനിറ്റിന് 120 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസ്).ശുദ്ധീകരിച്ച BDDE-HA ഹൈഡ്രോജൽ വിശകലനം വരെ 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സൂക്ഷിക്കുന്നു.
ക്രോസ്-ലിങ്ക് ചെയ്ത HA ഉൽപ്പന്നത്തിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന BDDE വിശകലനം ചെയ്യാൻ, 240 മില്ലിഗ്രാം സാമ്പിൾ തൂക്കി മധ്യഭാഗത്തെ ദ്വാരത്തിലേക്ക് (മൈക്രോകോൺ®; മെർക്ക് മില്ലിപോർ, ബില്ലെറിക്ക, MA, USA; വോളിയം 0.5 mL) അവതരിപ്പിക്കുകയും ഊഷ്മാവിൽ 10,000 rpm-ൽ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. 10 മിനിറ്റ്.മൊത്തം 20 μL പുൾ-ഡൗൺ ദ്രാവകം ശേഖരിക്കുകയും വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
ആൽക്കലൈൻ അവസ്ഥയിൽ (1%, 0.1%, 0.01% NaOH) BDDE സ്റ്റാൻഡേർഡ് (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച് കോ) വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിനായി, ഇനിപ്പറയുന്ന വ്യവസ്ഥകൾ പാലിക്കുകയാണെങ്കിൽ, ദ്രാവക സാമ്പിൾ 1:10, 1:100 അല്ലെങ്കിൽ വരെ 1:1,000,000 ആവശ്യമെങ്കിൽ, വിശകലനത്തിനായി MilliQ deionized വാട്ടർ ഉപയോഗിക്കുക.
ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് പ്രതികരണത്തിൽ (HA 2%, H2O, 1% NaOH, 0.049 mM BDDE) ഉപയോഗിക്കുന്ന ആരംഭ സാമഗ്രികൾക്കായി, ഈ മെറ്റീരിയലുകളിൽ നിന്ന് തയ്യാറാക്കിയ ഓരോ സാമ്പിളിന്റെയും 1 മില്ലി അതേ വിശകലന വ്യവസ്ഥകൾ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു.
അയോൺ മാപ്പിൽ ദൃശ്യമാകുന്ന കൊടുമുടികളുടെ പ്രത്യേകത നിർണ്ണയിക്കാൻ, 20 µL സാമ്പിളിൽ 10 μL 100 ppb BDDE സ്റ്റാൻഡേർഡ് സൊല്യൂഷൻ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച് കോ) ചേർത്തു.ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഓരോ സാമ്പിളിലെയും സ്റ്റാൻഡേർഡിന്റെ അന്തിമ സാന്ദ്രത 37 ppb ആണ്.
ആദ്യം, 10 μL സ്റ്റാൻഡേർഡ് BDDE (Sigma-Aldrich Co) 990 μL MilliQ വെള്ളത്തിൽ (സാന്ദ്രത 1.1 g/mL) നേർപ്പിച്ച് 11,000 mg/L (11,000 ppm) സാന്ദ്രതയുള്ള ഒരു BDDE സ്റ്റോക്ക് ലായനി തയ്യാറാക്കുക.110 µg/L (110 ppb) BDDE ലായനി ഒരു ഇന്റർമീഡിയറ്റ് സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡില്യൂഷനായി തയ്യാറാക്കാൻ ഈ പരിഹാരം ഉപയോഗിക്കുക.തുടർന്ന്, ആവശ്യമുള്ള ഏകാഗ്രത 75, 50, 25, 10, 1 പിപിബി നേടുന്നതിന് ഇന്റർമീഡിയറ്റ് ഡിലൂയന്റ് പലതവണ നേർപ്പിച്ച് സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് തയ്യാറാക്കാൻ ഇന്റർമീഡിയറ്റ് ബിഡിഡിഇ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡൈല്യൂന്റ് (110 പിപിബി) ഉപയോഗിക്കുക.ചിത്രം 1 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, 1.1 മുതൽ 110 ppb വരെയുള്ള BDDE സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവിന് നല്ല രേഖീയത (R2>0.99) ഉണ്ടെന്ന് കണ്ടെത്തി.നാല് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ സ്റ്റാൻഡേർഡ് കർവ് ആവർത്തിച്ചു.
LC-MS വിശകലനം വഴി ലഭിച്ച ചിത്രം 1 BDDE സ്റ്റാൻഡേർഡ് കാലിബ്രേഷൻ കർവ്, അതിൽ നല്ല പരസ്പരബന്ധം നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു (R2>0.99).
ചുരുക്കങ്ങൾ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി.
ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് എച്ച്എയിൽ നിലവിലുള്ള ബിഡിഡിഇ മാനദണ്ഡങ്ങളും അടിസ്ഥാന സൊല്യൂഷനിലെ ബിഡിഡിഇ മാനദണ്ഡങ്ങളും തിരിച്ചറിയുന്നതിനും കണക്കാക്കുന്നതിനും, എൽസി-എംഎസ് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ചു.
ഒരു LUNA 2.5 µm C18(2)-HST നിരയിൽ (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിക് വേർതിരിവ് നേടുകയും വിശകലന സമയത്ത് ഊഷ്മാവിൽ (25°C) സൂക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു.മൊബൈൽ ഘട്ടത്തിൽ 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡ് അടങ്ങിയ അസെറ്റോണിട്രൈലും (സോൾവെന്റ് എ) വെള്ളവും (ലായനി ബി) അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.മൊബൈൽ ഘട്ടം ഗ്രേഡിയന്റ് എല്യൂഷൻ വഴി ഒഴിവാക്കിയിരിക്കുന്നു.ഗ്രേഡിയന്റ് ഇപ്രകാരമാണ്: 0 മിനിറ്റ്, 2% A;1 മിനിറ്റ്, 2% എ;6 മിനിറ്റ്, 98% എ;7 മിനിറ്റ്, 98% എ;7.1 മിനിറ്റ്, 2% എ;10 മിനിറ്റ്, 2% A. പ്രവർത്തന സമയം 10 ​​മിനിറ്റും കുത്തിവയ്പ്പിന്റെ അളവ് 20 µL ഉം ആണ്.BDDE-യുടെ നിലനിർത്തൽ സമയം ഏകദേശം 3.48 മിനിറ്റാണ് (പരീക്ഷണങ്ങളുടെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ 3.43 മുതൽ 4.14 മിനിറ്റ് വരെ).LC-MS വിശകലനത്തിനായി മൊബൈൽ ഘട്ടം 0.25 mL/min എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റിൽ പമ്പ് ചെയ്തു.
BDDE വിശകലനത്തിനും MS-ന്റെ അളവെടുപ്പിനും വേണ്ടി, UPLC സിസ്റ്റം (വാട്ടേഴ്സ്) ഒരു API 3000 ട്രിപ്പിൾ ക്വാഡ്രുപോൾ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററുമായി (AB SCIEX) ഒരു ഇലക്ട്രോസ്പ്രേ അയോണൈസേഷൻ സോഴ്സ് സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ വിശകലനം പോസിറ്റീവ് അയോൺ മോഡിൽ (ESI+) നടത്തുന്നു.
BDDE-യിൽ നടത്തിയ അയോൺ ഫ്രാഗ്മെന്റ് വിശകലനം അനുസരിച്ച്, ഏറ്റവും ഉയർന്ന തീവ്രതയുള്ള ശകലം 129.1 Da ന് അനുയോജ്യമായ ശകലമാണെന്ന് നിർണ്ണയിച്ചു (ചിത്രം 6).അതിനാൽ, ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനായുള്ള മൾട്ടി-അയോൺ മോണിറ്ററിംഗ് മോഡിൽ (MIM), BDDE-യുടെ മാസ് കൺവേർഷൻ (മാസ്-ടു-ചാർജ് റേഷ്യോ [m/z]) 203.3/129.1 Da ആണ്.LC-MS വിശകലനത്തിനായി ഇത് പൂർണ്ണ സ്കാൻ (FS) മോഡും ഉൽപ്പന്ന അയോൺ സ്കാൻ (PIS) മോഡും ഉപയോഗിക്കുന്നു.
രീതിയുടെ പ്രത്യേകത പരിശോധിക്കുന്നതിനായി, ഒരു ശൂന്യ സാമ്പിൾ (പ്രാരംഭ മൊബൈൽ ഘട്ടം) വിശകലനം ചെയ്തു.ശൂന്യമായ സാമ്പിളിൽ 203.3/129.1 Da എന്ന മാസ് കൺവേർഷൻ ഉള്ള ഒരു സിഗ്നലും കണ്ടെത്തിയില്ല.പരീക്ഷണത്തിന്റെ ആവർത്തനക്ഷമത സംബന്ധിച്ച്, 55 ppb (കാലിബ്രേഷൻ കർവിന്റെ മധ്യത്തിൽ) 10 സ്റ്റാൻഡേർഡ് കുത്തിവയ്പ്പുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു, അതിന്റെ ഫലമായി ഒരു ശേഷിക്കുന്ന സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡീവിയേഷൻ (RSD) <5% (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല).
ശേഷിക്കുന്ന BDDE ഉള്ളടക്കം എട്ട് വ്യത്യസ്ത ഓട്ടോക്ലേവ്ഡ് BDDE ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് HA ഹൈഡ്രോജലുകളിൽ കണക്കാക്കി, നാല് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് അനുസൃതമായി."മെറ്റീരിയൽസ് ആൻഡ് മെത്തേഡ്സ്" വിഭാഗത്തിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ബിഡിഡിഇ സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഡില്യൂഷന്റെ റിഗ്രഷൻ കർവിന്റെ ശരാശരി മൂല്യം അനുസരിച്ചാണ് അളവ് വിലയിരുത്തുന്നത്, ഇത് 203.3/129.1 Da എന്ന BDDE മാസ് ട്രാൻസിഷനിൽ കണ്ടെത്തിയ തനതായ കൊടുമുടിയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. സമയം 3.43 മുതൽ 4.14 മിനിറ്റ് വരെ കാത്തിരിക്കുന്നില്ല.10 ppb BDDE റഫറൻസ് സ്റ്റാൻഡേർഡിന്റെ ഒരു ഉദാഹരണ ക്രോമാറ്റോഗ്രാം ചിത്രം 2 കാണിക്കുന്നു.എട്ട് വ്യത്യസ്ത ഹൈഡ്രോജലുകളുടെ ശേഷിക്കുന്ന BDDE ഉള്ളടക്കം പട്ടിക 1 സംഗ്രഹിക്കുന്നു.മൂല്യ ശ്രേണി 1 മുതൽ 2.46 ppb വരെയാണ്.അതിനാൽ, സാമ്പിളിലെ ശേഷിക്കുന്ന BDDE സാന്ദ്രത മനുഷ്യ ഉപയോഗത്തിന് സ്വീകാര്യമാണ് (<2 ppm).
203.30/129.10 Da (പോസിറ്റീവ് MRM മോഡിൽ) LC-MS വിശകലനം വഴി ലഭിച്ച 10 ppb BDDE റഫറൻസ് സ്റ്റാൻഡേർഡ് (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) സംക്രമണത്തിന്റെ ചിത്രം 2.
ചുരുക്കങ്ങൾ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി;MRM, ഒന്നിലധികം പ്രതികരണ നിരീക്ഷണം;MS, പിണ്ഡം;m/z, മാസ്-ടു-ചാർജ് അനുപാതം.
ശ്രദ്ധിക്കുക: 1-8 സാമ്പിളുകൾ ഓട്ടോക്ലേവ്ഡ് BDDE ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് HA ഹൈഡ്രോജലുകളാണ്.ഹൈഡ്രോജലിലെ ബിഡിഡിഇയുടെ ശേഷിക്കുന്ന അളവും ബിഡിഡിഇ നിലനിർത്തൽ സമയത്തിന്റെ ഏറ്റവും ഉയർന്ന അളവും റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെടുന്നു.അവസാനമായി, വ്യത്യസ്ത നിലനിർത്തൽ സമയങ്ങളുള്ള പുതിയ കൊടുമുടികളുടെ നിലനിൽപ്പും റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെടുന്നു.
ചുരുക്കങ്ങൾ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;എച്ച്എ, ഹൈലൂറോണിക് ആസിഡ്;MRM, ഒന്നിലധികം പ്രതികരണ നിരീക്ഷണം;tR, നിലനിർത്തൽ സമയം;LC-MS, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി;RRT, ആപേക്ഷിക നിലനിർത്തൽ സമയം.
ആശ്ചര്യകരമെന്നു പറയട്ടെ, LC-MS അയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രാമിന്റെ വിശകലനം, വിശകലനം ചെയ്ത എല്ലാ ഓട്ടോക്ലേവ്ഡ് ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് HA ഹൈഡ്രോജൽ സാമ്പിളുകളുടെയും അടിസ്ഥാനത്തിൽ, 2.73 മുതൽ 3.29 മിനിറ്റ് വരെ നിലനിർത്തൽ സമയത്ത് ഒരു അധിക പീക്ക് ഉണ്ടെന്ന് കാണിച്ചു.ഉദാഹരണത്തിന്, ചിത്രം 3 ഒരു ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് എച്ച്എ സാമ്പിളിന്റെ അയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രാം കാണിക്കുന്നു, അവിടെ ഏകദേശം 2.71 മിനിറ്റ് വ്യത്യസ്ത നിലനിർത്തൽ സമയത്ത് ഒരു അധിക പീക്ക് ദൃശ്യമാകുന്നു.പുതുതായി നിരീക്ഷിച്ച കൊടുമുടിയും BDDE-യിൽ നിന്നുള്ള കൊടുമുടിയും തമ്മിലുള്ള നിരീക്ഷിച്ച ആപേക്ഷിക നിലനിർത്തൽ സമയം (RRT) 0.79 ആണെന്ന് കണ്ടെത്തി (പട്ടിക 1).LC-MS വിശകലനത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന C18 നിരയിൽ പുതുതായി നിരീക്ഷിച്ച കൊടുമുടി കുറവാണെന്ന് ഞങ്ങൾക്കറിയാം, പുതിയ കൊടുമുടി BDDE-യെക്കാൾ കൂടുതൽ ധ്രുവീയ സംയുക്തവുമായി പൊരുത്തപ്പെടാം.
ചിത്രം 3 LC-MS വഴി ലഭിച്ച ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് HA ഹൈഡ്രോജൽ സാമ്പിളിന്റെ അയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രാം (MRM മാസ് കൺവേർഷൻ 203.3/129.0 Da).
ചുരുക്കങ്ങൾ: HA, ഹൈലൂറോണിക് ആസിഡ്;LC-MS, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി;MRM, ഒന്നിലധികം പ്രതികരണ നിരീക്ഷണം;RRT, ആപേക്ഷിക നിലനിർത്തൽ സമയം;tR, നിലനിർത്തൽ സമയം.
നിരീക്ഷിച്ച പുതിയ കൊടുമുടികൾ യഥാർത്ഥത്തിൽ ഉപയോഗിച്ച അസംസ്‌കൃത വസ്തുക്കളിൽ അടങ്ങിയിരിക്കുന്ന മലിനീകരണമാകാനുള്ള സാധ്യത തള്ളിക്കളയാൻ, ഈ അസംസ്‌കൃത വസ്തുക്കളും അതേ LC-MS വിശകലന രീതി ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു.വിശകലനം ചെയ്ത പ്രാരംഭ സാമഗ്രികളിൽ വെള്ളം, വെള്ളത്തിൽ 2% NaH, വെള്ളത്തിൽ 1% NaOH, ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് പ്രതികരണത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന അതേ സാന്ദ്രതയിൽ BDDE എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു.ഉപയോഗിച്ച സ്റ്റാർട്ടിംഗ് മെറ്റീരിയലിന്റെ അയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രാം സംയുക്തമോ കൊടുമുടിയോ കാണിച്ചില്ല, മാത്രമല്ല അതിന്റെ നിലനിർത്തൽ സമയം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ട പുതിയ കൊടുമുടിയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.പ്രാരംഭ മെറ്റീരിയലിൽ മാത്രമല്ല, വിശകലന പ്രക്രിയയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന ഏതെങ്കിലും സംയുക്തങ്ങളോ പദാർത്ഥങ്ങളോ അടങ്ങിയിരിക്കാമെന്ന ആശയം ഈ വസ്തുത നിരാകരിക്കുന്നു, എന്നാൽ മറ്റ് ലബോറട്ടറി ഉൽപ്പന്നങ്ങളുമായി ക്രോസ്-മലിനീകരണം ഉണ്ടാകാനുള്ള ഒരു സൂചനയും ഇല്ല.ബിഡിഡിഇയുടെ LC-MS വിശകലനത്തിന് ശേഷം ലഭിച്ച ഏകാഗ്രത മൂല്യങ്ങളും പുതിയ കൊടുമുടികളും പട്ടിക 2ലും (സാമ്പിളുകൾ 1-4) ചിത്രം 4-ലും അയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രാം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.
ശ്രദ്ധിക്കുക: 1-4 സാമ്പിളുകൾ ഓട്ടോക്ലേവ്ഡ് BDDE ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് HA ഹൈഡ്രോജലുകൾ നിർമ്മിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന അസംസ്കൃത വസ്തുക്കളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.ഈ സാമ്പിളുകൾ ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്തിട്ടില്ല.
ചുരുക്കങ്ങൾ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;എച്ച്എ, ഹൈലൂറോണിക് ആസിഡ്;LC-MS, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി;MRM, ഒന്നിലധികം പ്രതികരണ നിരീക്ഷണം.
HA, BDDE എന്നിവയുടെ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് പ്രതികരണത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന അസംസ്കൃത വസ്തുക്കളുടെ ഒരു സാമ്പിളിന്റെ LC-MS ക്രോമാറ്റോഗ്രാമുമായി ചിത്രം 4 യോജിക്കുന്നു.
ശ്രദ്ധിക്കുക: ഇവയെല്ലാം ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് റിയാക്ഷൻ നടത്താൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന അതേ സാന്ദ്രതയിലും അനുപാതത്തിലും അളക്കുന്നു.ക്രോമാറ്റോഗ്രാം വിശകലനം ചെയ്ത അസംസ്കൃത വസ്തുക്കളുടെ സംഖ്യകൾ ഇവയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു: (1) വെള്ളം, (2) 2% HA ജലീയ ലായനി, (3) 1% NaOH ജലീയ ലായനി.203.30/129.10 Da (പോസിറ്റീവ് MRM മോഡിൽ) മാസ് പരിവർത്തനത്തിനായി LC-MS വിശകലനം നടത്തുന്നു.
ചുരുക്കങ്ങൾ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;എച്ച്എ, ഹൈലൂറോണിക് ആസിഡ്;LC-MS, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി;MRM, ഒന്നിലധികം പ്രതികരണ നിരീക്ഷണം.
പുതിയ കൊടുമുടികൾ രൂപപ്പെടാൻ കാരണമായ സാഹചര്യങ്ങൾ പഠിച്ചു.ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് എച്ച്എ ഹൈഡ്രോജൽ ഉത്പാദിപ്പിക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രതികരണ സാഹചര്യങ്ങൾ BDDE ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗ് ഏജന്റിന്റെ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെ എങ്ങനെ ബാധിക്കുന്നു എന്ന് പഠിക്കാൻ, ഇത് പുതിയ കൊടുമുടികളുടെ രൂപീകരണത്തിലേക്ക് നയിക്കുന്നു (സാധ്യമായ ഉപോൽപ്പന്നങ്ങൾ), വ്യത്യസ്ത അളവുകൾ നടത്തി.ഈ നിർണ്ണയങ്ങളിൽ, ഞങ്ങൾ അന്തിമ BDDE ക്രോസ്‌ലിങ്കർ പഠിക്കുകയും വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു, അത് ഒരു ജലീയ മാധ്യമത്തിൽ NaOH (0%, 1%, 0.1%, 0.01%) വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതകൾ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു, തുടർന്ന് ഓട്ടോക്ലേവിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ അല്ലാതെ.ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് എച്ച്എ ഹൈഡ്രോജൽ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന് ഉപയോഗിക്കുന്ന അതേ അവസ്ഥയെ അനുകരിക്കാനുള്ള ബാക്ടീരിയ നടപടിക്രമം തന്നെയാണ്."സാമഗ്രികളും രീതികളും" വിഭാഗത്തിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, സാമ്പിളിന്റെ ബഹുജന സംക്രമണം LC-MS 203.30/129.10 Da-ലേക്ക് വിശകലനം ചെയ്തു.BDDE യും പുതിയ കൊടുമുടിയുടെ സാന്ദ്രതയും കണക്കാക്കുന്നു, ഫലങ്ങൾ പട്ടിക 3-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ലായനിയിൽ NaOH ന്റെ സാന്നിധ്യം പരിഗണിക്കാതെ തന്നെ ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്യാത്ത സാമ്പിളുകളിൽ പുതിയ കൊടുമുടികളൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല (സാമ്പിളുകൾ 1-4, പട്ടിക 3).ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്ത സാമ്പിളുകൾക്ക്, ലായനിയിലെ NaOH ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ മാത്രമേ പുതിയ കൊടുമുടികൾ കണ്ടെത്തുകയുള്ളൂ, കൂടാതെ പീക്ക് രൂപീകരണം ലായനിയിലെ NaOH സാന്ദ്രതയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു (സാമ്പിളുകൾ 5-8, പട്ടിക 3) (RRT = 0.79).ചിത്രം 5 ഒരു അയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രാമിന്റെ ഒരു ഉദാഹരണം കാണിക്കുന്നു, NAOH ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിലോ അഭാവത്തിലോ രണ്ട് ഓട്ടോക്ലേവ്ഡ് സാമ്പിളുകൾ കാണിക്കുന്നു.
ചുരുക്കങ്ങൾ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി;MRM, ഒന്നിലധികം പ്രതികരണ നിരീക്ഷണം.
ശ്രദ്ധിക്കുക: മുകളിലെ ക്രോമാറ്റോഗ്രാം: സാമ്പിൾ 0.1% NaOH ജലീയ ലായനി ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുകയും ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു (20 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 120 ° C).താഴെയുള്ള ക്രോമാറ്റോഗ്രാം: സാമ്പിൾ NaOH ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചിട്ടില്ല, എന്നാൽ അതേ വ്യവസ്ഥകളിൽ ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്തു.203.30/129.10 Da (പോസിറ്റീവ് MRM മോഡിൽ) യുടെ മാസ് കൺവേർഷൻ LC-MS വിശകലനം ചെയ്തു.
ചുരുക്കങ്ങൾ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി;MRM, ഒന്നിലധികം പ്രതികരണ നിരീക്ഷണം.
NaOH ഉള്ളതോ അല്ലാത്തതോ ആയ എല്ലാ ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്ത സാമ്പിളുകളിലും, BDDE കോൺസൺട്രേഷൻ വളരെ കുറഞ്ഞു (16.6 മടങ്ങ് വരെ) (സാമ്പിളുകൾ 5-8, പട്ടിക 2).ഉയർന്ന ഊഷ്മാവിൽ ജലത്തിന് ഒരു അടിത്തറയായി (ന്യൂക്ലിയോഫൈൽ) പ്രവർത്തിച്ച് ബിഡിഡിഇയുടെ എപ്പോക്സൈഡ് റിംഗ് തുറന്ന് 1,2-ഡയോൾ സംയുക്തം രൂപപ്പെടുത്താൻ കഴിയുമെന്നതാണ് ബിഡിഡിഇയുടെ സാന്ദ്രത കുറയുന്നതിന് കാരണം.ഈ സംയുക്തത്തിന്റെ മോണോ ഐസോടോപ്പിക് ഗുണനിലവാരം BDDE യുടേതിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്, അതിനാൽ ഇത് ബാധിക്കില്ല.LC-MS 203.30/129.10 Da എന്ന മാസ് ഷിഫ്റ്റ് കണ്ടെത്തി.
അവസാനമായി, ഈ പരീക്ഷണങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് പുതിയ കൊടുമുടികൾ സൃഷ്ടിക്കുന്നത് BDDE, NAOH, ഓട്ടോക്ലേവിംഗ് പ്രക്രിയ എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു, എന്നാൽ HA യുമായി യാതൊരു ബന്ധവുമില്ല.
ഏകദേശം 2.71 മിനിറ്റ് നിലനിർത്തൽ സമയത്ത് കണ്ടെത്തിയ പുതിയ കൊടുമുടി പിന്നീട് LC-MS സവിശേഷതയായിരുന്നു.ഈ ആവശ്യത്തിനായി, BDDE (9.9 mg/mL) 1% NaOH ജലീയ ലായനിയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.പട്ടിക 4-ൽ, പുതിയ കൊടുമുടിയുടെ സവിശേഷതകൾ അറിയപ്പെടുന്ന BDDE റഫറൻസ് പീക്കുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുന്നു (നിലനിർത്തൽ സമയം ഏകദേശം 3.47 മിനിറ്റ്).രണ്ട് കൊടുമുടികളുടെ അയോൺ ഫ്രാഗ്മെന്റേഷൻ വിശകലനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, 2.72 മിനിറ്റ് നിലനിർത്തൽ സമയമുള്ള കൊടുമുടി BDDE കൊടുമുടിയുടെ അതേ ശകലങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു, എന്നാൽ വ്യത്യസ്ത തീവ്രതയോടെ (ചിത്രം 6) എന്ന് നിഗമനം ചെയ്യാം.2.72 മിനിറ്റ് നിലനിർത്തൽ സമയത്തിന് (PIS) അനുരൂപമായ കൊടുമുടിക്ക്, 147 Da പിണ്ഡത്തിൽ വിഘടനത്തിന് ശേഷം കൂടുതൽ തീവ്രമായ കൊടുമുടി നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.ഈ നിർണ്ണയത്തിൽ ഉപയോഗിച്ച BDDE കോൺസൺട്രേഷനിൽ (9.9 mg/mL), അൾട്രാവയലറ്റ് സ്പെക്ട്രത്തിലെ വ്യത്യസ്ത അബ്സോർബൻസ് മോഡുകളും (UV, λ=200 nm) ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിക് വേർതിരിവിന് ശേഷം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം 7).2.71 മിനിറ്റ് നിലനിർത്തൽ സമയമുള്ള കൊടുമുടി ഇപ്പോഴും 200 nm-ൽ ദൃശ്യമാണ്, അതേസമയം BDDE കൊടുമുടി അതേ അവസ്ഥയിൽ ക്രോമാറ്റോഗ്രാമിൽ നിരീക്ഷിക്കാൻ കഴിയില്ല.
പട്ടിക 4, ഏകദേശം 2.71 മിനിറ്റ് നിലനിർത്തൽ സമയമുള്ള പുതിയ കൊടുമുടിയുടെ സ്വഭാവ ഫലങ്ങൾ, 3.47 മിനിറ്റ് നിലനിർത്തൽ സമയമുള്ള BDDE പീക്ക്
കുറിപ്പ്: ഈ ഫലങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിന്, രണ്ട് കൊടുമുടികളിൽ LC-MS, HPLC വിശകലനങ്ങൾ (MRM, PIS) നടത്തി.HPLC വിശകലനത്തിനായി, 200 nm തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള UV കണ്ടെത്തൽ ഉപയോഗിക്കുന്നു.
ചുരുക്കങ്ങൾ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;HPLC, ഉയർന്ന പ്രകടനമുള്ള ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി;LC-MS, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി;MRM, ഒന്നിലധികം പ്രതികരണ നിരീക്ഷണം;m/z, മാസ്-ടു-ചാർജ് അനുപാതം;PIS, ഉൽപ്പന്ന അയോൺ സ്കാനിംഗ്;അൾട്രാവയലറ്റ് ലൈറ്റ്, അൾട്രാവയലറ്റ് ലൈറ്റ്.
ശ്രദ്ധിക്കുക: എൽസി-എംഎസ് വിശകലനം (പിഐഎസ്) വഴിയാണ് മാസ് ശകലങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നത്.ടോപ്പ് ക്രോമാറ്റോഗ്രാം: BDDE സ്റ്റാൻഡേർഡ് സാമ്പിൾ ശകലങ്ങളുടെ മാസ് സ്പെക്ട്രം.താഴെയുള്ള ക്രോമാറ്റോഗ്രാം: കണ്ടെത്തിയ പുതിയ കൊടുമുടിയുടെ മാസ് സ്പെക്ട്രം (BDDE കൊടുമുടിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട RRT 0.79 ആണ്).BDDE 1% NaOH ലായനിയിൽ പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുകയും ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
ചുരുക്കങ്ങൾ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS, ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി, മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി;MRM, ഒന്നിലധികം പ്രതികരണ നിരീക്ഷണം;PIS, ഉൽപ്പന്ന അയോൺ സ്കാൻ;RRT, ആപേക്ഷിക നിലനിർത്തൽ സമയം.
ചിത്രം 7 203.30 Da മുൻഗാമി അയോണിന്റെ അയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രാം, കൂടാതെ (A) 2.71 മിനിറ്റ് നിലനിർത്തൽ സമയമുള്ള പുതിയ പീക്ക്, (B) 200 nm-ൽ 3.46 മിനിറ്റിൽ BDDE റഫറൻസ് സ്റ്റാൻഡേർഡ് പീക്കിന്റെ UV കണ്ടെത്തൽ.
ഉൽപ്പാദിപ്പിച്ച എല്ലാ ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് എച്ച്എ ഹൈഡ്രോജലുകളിലും, LC-MS ക്വാണ്ടിഫിക്കേഷനു ശേഷമുള്ള ശേഷിക്കുന്ന BDDE കോൺസൺട്രേഷൻ <2 ppm ആണെന്ന് നിരീക്ഷിച്ചു, എന്നാൽ വിശകലനത്തിൽ ഒരു പുതിയ അജ്ഞാത കൊടുമുടി പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ടു.ഈ പുതിയ കൊടുമുടി BDDE സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഉൽപ്പന്നവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നില്ല.BDDE സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഉൽപ്പന്നവും പോസിറ്റീവ് MRM മോഡിൽ അതേ ഗുണനിലവാര പരിവർത്തനത്തിന് (MRM പരിവർത്തനം 203.30/129.10 Da) വിധേയമായിട്ടുണ്ട്.സാധാരണയായി, ഹൈഡ്രോജലുകളിൽ BDDE കണ്ടുപിടിക്കാൻ ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫി പോലുള്ള മറ്റ് വിശകലന രീതികൾ പരിധി ടെസ്റ്റുകളായി ഉപയോഗിക്കുന്നു, എന്നാൽ പരമാവധി കണ്ടെത്തൽ പരിധി (LOD) 2 ppm-നേക്കാൾ അല്പം കുറവാണ്.മറുവശത്ത്, ഇതുവരെ, ക്രോസ്-ലിങ്ക്ഡ് എച്ച്എ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ പഞ്ചസാര യൂണിറ്റ് ശകലങ്ങളിൽ എച്ച്എയുടെ ക്രോസ്-ലിങ്കിംഗിന്റെ കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ പരിഷ്ക്കരണത്തിന്റെ അളവ് വ്യക്തമാക്കാൻ എൻഎംആർ, എംഎസ് എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചിട്ടുണ്ട്.ഈ ടെക്നിക്കുകളുടെ ഉദ്ദേശ്യം ഈ ലേഖനത്തിൽ നാം വിവരിക്കുന്നതുപോലെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിൽ ശേഷിക്കുന്ന BDDE കണ്ടെത്തൽ അളക്കുക എന്നതായിരുന്നില്ല (ഞങ്ങളുടെ LC-MS രീതിയുടെ LOD = 10 ppb).